精品文档就在这儿-------------各类专业好文档，值得你下载，教育，办理，论文，准则，计划手册，包罗万象-------------- ---------------------------------------------------------精品文档 镍柱别离纯化固定金属离子亲和柱首要用于金属螯化离子。坐落许多蛋白中的组氨酸残基将会和许多金属 离子，例如锌。铜，镍，铁等构成复合物。因而，该柱料能挑选性螯合一些具有组氨酸残基 的蛋白质。可是半胱氨酸和咯氨酸残基也能和固定化金属螯和。可是亲和力比组氨酸要弱。 所以，结合的强度是和缓冲液的PH 和金属离子决议的。 金属螯和柱料首要是由亚氨基的乙酰乙酸成分耦联琼脂糖柱料，凭借醚长生7 个原子的空间。 悉数容量：24-30um 的含有zn 柱料结构：6%的高铰链的琼脂糖柱料巨细：45-165um 均匀微粒：90um 直流速度：25 度/0.1MPa/30 厘米高度/每小时可达700厘米 最大压强：0.3MPa PH 改动：长时间3-13 短期2-14 化学安稳：通用含水缓冲液 0.01M 盐酸，1.0M NAOH, 20%乙醇（保存7 物理性质：能够疏忽在PH或许离子改动下的体积改动 耐热功能：121 度下0.1M 乙酸钠效果半小时 金属螯和柱料保存于事前填充于20%乙醇。所以要拌和驱除20%乙醇溶液。换成去离子水。 份额是25%去离子水和75%处理胶。 处理金属螯和柱料： 固定adaptor，翻开柱子开关，开端缓冲液的活动。先以填鸭的速度直到柱床安稳后。固定金属离子： 金属螯和柱料经过水来螯和金属的，防止产生沉积在胶上。 保证柱子现已平衡好。假如有必要能够洗2个柱床（去离子水） 挑选金属离子和0.1-0.3M中弱性酸。例如铁离子PH 至少2倍柱床的平衡缓冲液 精品文档就在这儿 -------------各类专业好文档，值得你下载，教育，办理，论文，准则，计划手册，包罗万象-------------- ---------------------------------------------------------精品文档 结合：产生于PH5.5-8.5 之间.最强反映产生于终究 初始缓冲液的挑选决议于金属离子和样品的结合性质。乙酸钠或许磷酸钠是比较好的缓冲液 中不能运用EDTA 或许柠檬酸盐 最通用缓冲液： 0.01-0.2M 磷酸钠 0.05M 乙酸钠 强烈引荐参加0.15-0.5M NaCl 用于防止离子交换。 一般假如不知道一个蛋白的结合才能，最好的便是运用锌离子和中性的磷酸或许乙酸盐，同 时含有0.15-0.5M NaCl 去垢剂不会影响蛋白质的结合才能 金属离子的替代意味着蛋白产生了结合。这种现象能够经过色彩来决议 洗脱蛋白：（3 种办法） 下降PH(一步或许分步)，大部分蛋白溶解于PH4-6终究3-4 是可容的。可挑选柠檬酸盐， 磷酸或许乙酸盐。 逐步进步咪唑的浓度（0-0.5M），梯度改动最好是在初始缓冲液的PH规模。 参加EDTA或许EGTA 可洗脱蛋白质。可是不是通用的。 运用离心或许重力效果纯化组氨酸位点蛋白 经过上镍进行挑选性结合含有组氨酸位点蛋白，然后运用含有咪唑的缓冲液洗脱蛋白。 以下的试验是为了最大化将组氨酸位点蛋白结合到金属螯和柱料，然后保证能够洗脱下来。 当结合和洗脱的条件没有明晰时，这些办法也是很好用的。 为了取得高纯度的蛋白，有必要探索咪唑的缓冲液在样品上柱和洗脱时的浓度。一般运用 10mM-500mM 规模的咪唑的缓冲液进行剃度洗脱，然后经过搜集和SDS-PAGE 蛋白电泳确认洗 脱浓度。 为了纯化不可容的含有 his 位点的蛋白质，（包括体），能够在变性条件下进行。运用 8M 尿素或许6M 盐酸呱进行溶解蛋白。 样品处理： 样品要经或许溶解，防止呈现阻塞现象，所以能够运用0.45uM 虑膜过滤杂志 假如样品时溶解于20mM 磷酸缓冲液中（含有0.5M Nacl,PH7.4），有必要调整PH 到7－8。 上柱前预备： 运用吸管吸出足量柱料用以纯化意图。每毫升柱料能够吸纳5毫克蛋白 500g离心2－5 分钟，沉积柱料。 参加5倍体积去离子水，充沛振动柱料。能够倒置来回5 分钟，不要机械拌和。 再次500g离心2－5 分钟，沉积柱料。 参加0.5倍柱床体积0.1M 硫酸镍，充沛振动柱料。能够倒置来回5 分钟，不要机械拌和。 500g离心2－5 分钟，沉积柱料。 精品文档就在这儿 -------------各类专业好文档，值得你下载，教育，办理，论文，准则，计划手册，包罗万象-------------- ---------------------------------------------------------精品文档 参加5倍体积去离子水，充沛振动柱料，来回倒置5 分钟 500g离心2－5 分钟，沉积柱料。 终究用一倍体积开始缓冲液充旋柱料（20mMNa2HPO4 /0.5MnaCl/10mM 咪唑/PH7.4） 运用离心来纯化： 亲柔拌和，室温离心5－30分钟，结合才能取决于蛋白和样品浓度。 500g离心2－5 分钟，沉积柱料。 取出上清。部分用于SDS-PAGE蛋白电泳 参加5倍体积开始缓冲液，拌和5 分钟 500g离心2－5 分钟，沉积柱料。 取出上清。部分用于SDS-PAGE蛋白电泳 柱床开始缓冲液）。记住取出上清，部分用于SDS-PAGE蛋白 电泳 参加2倍体积洗脱缓冲液（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM 咪唑/PH7.4）拌和5 分钟 再次500g离心2－5 分钟，沉积柱料。 柱床洗脱缓冲液）。记住取出上清，部分用于SDS-PAGE蛋白电 泳，280nM 吸光值，ELISA,WESTERN 运用流速和重力纯化： 加柱帽，去除剩余水。引荐是最多2Ml 柱料就能够了 样品结合： 小心上样，用波棒室温拌和5－30分钟 参加5倍体积开始缓冲液，搜集流出液用于SDS-PAGE 蛋白电泳 柱床开始缓冲液）。记住取出上清，部分用于SDS-PAGE蛋白 电泳 加上柱帽，参加2倍体积洗脱缓冲液（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM 咪唑/PH7.4）搅 柱床洗脱缓冲液）。记住取出上清，部分用于SDS-PAGE蛋白电 泳，280nM 吸光值，ELISA,WESTERN 精品文档就在这儿 -------------各类专业好文档，值得你下载，教育，办理，论文，准则，计划手册，包罗万象-------------- ---------------------------------------------------------精品文档 留意：0.5M咪唑的280nM 吸光值＝0.5 常见问题： 样品太粘稠答：核酸存在影响，能够持续超声，参加RNA 酶至10ug/ml DNA 酶至5ug/ml。然后冰浴1 0－15 分钟。或许也能够用注射器来回充旋。这样能够防止阻塞柱料。 查看PH和缓冲液成分，假如缓冲液成分不正确，EDTA 参加，强还原剂参加，都会导致 这个现象呈现。 加大胶的量，假如胶料承载才能过头，也绘出呈现这现象。 预备新鲜的柱料，假如柱料开裂，也挂不上蛋白。 在洗脱液中不含有组氨酸蛋白答：假如SDS-PAGE 蛋白电泳现已发现蛋白存在于超声液中 超声或许不完全。能够用显微镜调查超声状况。AD260/280 比值。（一般是超声前将10mg/ml 溶菌酶参加25mM Tris-HCL，PH6-8），防止发泡以降解交融蛋白。 蛋白或许是是包括体，能够运用4－6M 盐酸呱或许4－8 尿素溶解。尿素溶解的能够进行SDS-PAGE 蛋白电泳，盐酸呱溶解的不能够进行SDS-PAGE 蛋白电泳， 有必要换缓冲液。 洗脱液浓度太稀，能够加大咪唑浓度或许下降PH 来决议最佳洗脱条件假如在平衡前的洗柱 发现了意图蛋白，证明开始缓冲液中的咪唑浓度太高，可适当下降。 考马氏亮蓝或许银染发现多条带答：参加蛋白激酶抑制剂。或许是蛋白降解。用凝血酶切开前有必要去除丝氨酸蛋白酶抑制剂 选用梯度咪唑来洗脱蛋白。在平衡洗脱液中参加10mM 咪唑能够洗脱很多杂质而不会洗脱融 合蛋白。低于500mM 咪唑能够洗掉绝大部分杂质。 在洗脱步奏往开始缓冲液参加去垢剂（2％TRITON x-100 或许2％Tween20）50% 葡萄糖，20mM B-巯基乙醇。记住杂质一般没有特意结合才能，能够改动缓冲液来洗脱。 假如杂志和意图蛋白有相同结合才能，那就不能用于纯化。因而能够运用其他纯化体系，例 如含有GST 尾巴就用谷胱甘肽琼脂糖4B 柱料再生，清洁和保存 柱料再生： 运用0.05MEDTA,0.5M NaCl 来洗脱镍离子。然后用3 柱床的0.5M NaCl 来洗洁净EDTA 假如是铁离子能够用0.05MEDTA 泡过夜 这一步能够洗脱上面未能洗脱的剩余结合蛋白清洗柱料： NaCl，反向洗脱10－15分钟 1MNaOH 每一步都要用3倍柱床开始缓冲液清洗 倍柱床70%乙醇洗脱强亲水蛋白和脂类蛋白。也能够运用2 倍柱床去垢剂。0.1-0.5%非离子去垢剂溶于0.1M 乙酸。浸泡1－2 小时。终究 个柱床的70％乙醇去除去垢剂。清洁： 0.5-1MNaOH 反向活动半小时 精品文档就在这儿 -------------各类专业好文档，值得你下载，教育，办理，论文，准则，计划手册，包罗万象-------------- ---------------------------------------------------------精品文档 再用3－5倍柱床消毒的开始缓冲液平衡 这个清洁步奏纷歧定能够进步纯化才能保存： 长时间保存于20％乙醇或许0.01M NaOH

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