A：上述缓冲液为开端缓冲液，意图蛋白质不同，或许需求不同的纯化缓冲液。详细运用能够参阅分子克隆等工具书或许文献对缓冲液做修正。也能够依据蛋白质性质对上述缓冲液做修正

　　Q：冻融怎样做，重复冻融几回：A：从-80°拿出来，再放进去重复冻融至少3次

　　Q：意图蛋白质在PH7.4下不安稳：A：能够在pH7.3-8.3的规模内对缓冲液的pH调整

　　Q：洗杂蛋白时意图蛋白质也洗脱：A：加5%甘油，0.1% tritonX100，0.5M NaCl或许会有作用，起到以下两个作用：（1）削减非特异吸附：甘油，去垢剂（triton），NaCl 都能够削减蛋白间疏水作用下降非特异吸附， 使杂蛋白更简单洗脱；

　　A：一些状况下，缓冲液中添加5%-10%的甘油，0.1%的tween，0.5M的NaCl会进步蛋白质纯化的作用。

　　Q：破菌时能够用EDTA做蛋白酶抑制剂吗A：能够恰当参加PMSF作为蛋白酶抑制剂，可是不能运用EDTA。

　　Q：我购买的是1ml预装柱，十倍柱体积平衡是指10ml上样缓冲液平衡吗A：是

　　Q：一个进程下来需求多长期？正常流速每秒多少滴A：重力柱，一般1s流速50ul左右机械柱能够仪器调理，一般跟重力柱比能够快50-100%

　　Q：假如流速过慢，怎样处理A：能够运用硅胶管操控上样速度。或预装柱下面接软管，再接蠕动泵

　　Q：正常流速过一次柱就能够充沛结合了吗？是否需求多过几回柱？A：一次就能够，假如流速过快，能够再过一次

　　Q：上样完结后，是否可直接进入洗杂进程A：样品上完今后，运用上样缓冲液洗柱10个柱体积，留意将纯化柱侧壁上的残留样品洗洁净。

　　Q：怎样洗去杂蛋白A：运用10-20倍柱体积洗杂缓冲液将杂蛋白从纯化柱上洗去，假如杂蛋白太多能够加大洗杂体积。

　　Q：杂带多，杂蛋白洗不掉怎样办A：添加咪唑浓度，若仍无好转，测验下：洗杂液中添加NaCl到150mM【Nacl浓度最高不要超越500mM】，TritonX100到1%【作用去掉柱料的一些非特异性吸附】，甘油到5%

　　Q：怎样洗脱意图蛋白A：洗杂完毕今后，运用4-10倍柱体积洗脱缓冲液将方针蛋白洗脱。一般方针蛋白会在第二个柱体积中开端流出。

　　Q：难以洗脱意图蛋白A：难以洗脱的蛋白最高可用咪唑浓度500mM，或许EDTA连同镍离子一同洗脱（不得已的办法）。

　　Q：怎样判别搜集的液体中有意图蛋白A：搜集液中的意图蛋白质用SDS-PAGE检测。

　　Q：纯化完结后怎样处理柱子/保存柱子A：搜集完结今后，运用8M尿素或许6M盐酸胍5倍柱体积洗柱，再运用许多蒸馏水水洗柱，关闭纯化管上下两头保存在4 ℃，不要在-20 ℃冻住。假如长期不必，参加5 ml 20%乙醇关闭保存。

　　Q：哪些状况下需求镍柱重生A：His•Bind Resin能够屡次运用，不需求再生。假如需求运用一根柱子纯化不同方针蛋白，或许长期运用形成金属离子掉落，柱子阻塞、流速慢，能够依照下述办法进行再生。

　　Q：怎样重生A：1. 用0.1 M EDTA洗柱4倍柱体积，将金属离子洗脱下来，再用蒸馏水洗柱10倍柱体积除掉EDTA残留。2. 运用0.2 M醋酸洗柱4倍柱体积，10倍柱体积蒸馏水冲刷，再用0.1M 氢氧化钠洗柱4倍柱体积， PBS/TBS平衡pH，许多蒸馏水洗柱。这一步需求避免强酸、强碱洗柱时刻过长。

　　4. 柱子长期不必，参加20% 乙醇，封口后于4摄氏度保存，避免干裂或许冻住。

　　Q：堵柱严峻，怎样办A：假如柱子阻塞严峻，重生时运用1% Triton X-100/PBS浸泡过夜。

　　Q：运用进程中发现阻塞严峻，且流速越来越慢A：样品处理进程中，高速离心，最好用0.45um的滤膜过滤（引荐）假如柱子阻塞严峻，重生时运用1% Triton X-100/PBS浸泡过夜。

　　Q：是否有必要冰上操作？常温是否能够？A：在不知道Ni-NTA His•Bind Resin交融蛋白安稳性的状况下，整个纯化进程最好在4℃完结

　　Q：是否能够用EDTAA：能够运用蛋白酶抑制剂避免降解，可是EDTA应当在纯化完结今后再参加。

　　Q：咱们的样品品种较多，能够用同一根柱子吗A：最好不同的交融蛋白运用不同的柱子，样品较多，能够运用多根柱子，或许纯化完一种样本后需重生后再纯化别的一种蛋白。

　　Q：有哪些办法能够削减杂蛋白的结合A：上样缓冲液中能够含有1 mM咪唑削减杂蛋白的结合

　　Q：我的意图蛋白在咪唑20mM时就掉下来了A：部分方针蛋白会在20 mM咪唑洗杂缓冲液中流出，所以关于新样品，每一步都要留样电泳，探索纯化条件。

　　Q：我的意图蛋白是包容体方式，怎样变性A：假如交融蛋白是包容体方式，那么能够挑选变性纯化办法，一般是在缓冲液中参加8M 尿素以及去垢剂。变性纯化时必定要做好样品处理，否则简单形成柱子阻塞。

　　Q：变性后的蛋白怎样处理A：变性办法得到的蛋白一般没有生机，能够用来制备抗体，但如想测定生机，就需求做复性。

　　Q：变性蛋白怎样复性A：蛋白质复性办法有许多种，稀释法、透析法、离子交换复性法，分子筛复性法，自己挑选适宜的办法来做。

　　Q：除了能够咪唑洗脱，还有其他办法能够洗脱吗A：除了常规的咪唑洗脱办法以外，还有EDTA洗脱和pH梯度洗脱。后两种办法缺陷显着，只在特别状况下运用。

　　Q：去除his 标签的办法A：能够运用在柱酶切的办法得到去除His-tag的方针蛋白。常常运用的酶包含：Thrombin；Enterokinase；TEV protease等。咱们引荐TEV protease（货号：RPP002），由于这种酶的特异性较好，是带有Ni-NTA His•Bind Resin的重组酶，便利除掉。在柱酶切能够进步产品纯度，可是空间位阻或许形成酶切作用欠好，依照常规，大都试验不必切除Ni-NTA His•Bind Resin。

　　Q：金属离子掉落，柱子失掉色彩或许变色A：确证破菌缓冲液中不含有EDTA、EGTA、柠檬酸、DTT等螯合剂；从头处理柱子，为His-Binding-resin螯合金属离子。

　　Q：交融蛋白是包容体A：下降表达温度（16-22℃），下降IPTG诱导浓度（10-100 μM），缩短诱导时刻（2-5小时）；做包容体复性，或许运用变性纯化。

　　Q：交融蛋白不结合A：测序查看核酸序列，将tag从一端移到另一端，添加接头序列。

　　Q：纯化的蛋白没有活性A：调整破菌条件，超声发生的热量或许使GST蛋白变性。

　　Q：交融蛋白被蛋白酶降解A：在破菌缓冲液中参加蛋白酶抑制剂，缩短纯化时刻，下降温度。

　　Q：交融蛋白不能从柱子上洗脱A：参加0.1% TritonX-100；添加NaCl浓度；运用变性纯化。

　　Q：交融蛋白被蛋白酶降解A：在破菌缓冲液中参加蛋白酶抑制剂，缩短纯化时刻，下降温度。

　　Q：有些宿主细胞的分子伴侣蛋白会与交融蛋白结合A：上样前参加5 mM DTT，或许运用10 mM MgSO4 50 mM Tris，2 mM ATP先反响20分钟，让伴侣蛋白去结合。

　　Q：超声裂菌过度，方针蛋白被打断A：留意超声仪的作业功率以及超声时刻，运用显微镜操控裂菌。

　　Q：金属离子亲和柱十分简单发生非特异性吸附，特别是在方针蛋白表达量较低时A：在上样缓冲液中参加去垢剂，能够有多种挑选；加大方针蛋白上样量；削减bead运用量；加大盐离子浓度；咪唑梯度洗脱；变性纯化等等。

　　Q：PMSF是否能够不加A：PMSF为蛋白酶抑制剂，作用是避免意图蛋白被降解，能够不加

　　Q：破菌液中加咪唑吗A：能够不加，如必定要加，主张能够加1-5mM，加了会竞赛结合，削减杂蛋白的结合，添加杂蛋白的穿出

　　Q：重复运用，功率不高，怎样办A：在第一次运用后，处理一下“8mol 尿素 冲刷（1ml镍柱对应20ml尿素），用水冲刷洁净尿素，上0.1mol 硫酸镍 （1ml镍柱对应1ml硫酸镍）”，然后再进行后边的操作

　　Q：柱子上面的垫片试验时是否需求取出，垫片是什么作用A：不要取出，垫片的作用：1、挡住脏东西；2、避免胶飘起来

　　Q：结合不到蛋白或结合力弱A：1. Binding buffer(或许细胞裂解buffer)咪唑浓度不要超越5mM，NTA和HIS-Tag的结合力较弱所以最好不加咪唑，先把蛋白binding上去再洗杂蛋白；

　　buffer中不要有EDTA(能够螯合镍)，DTT等复原剂（能够复原镍）。

　　蛋白折叠后his-tag被包裹在内部，无法露出出来与镍柱结合； 能够测验在蛋白中参加变性剂尿素（2M-8M）在部分或彻底变性 的条件下纯化蛋白。

　　镍柱产品比较特别，涉及到纯化蛋白与抗原的匹配问题，现在咱们的镍柱适配度能到达80%左右。

　　Q：来源于哪些表达体系的His蛋白有很好的纯化作用（原核？真核？例如杆状病毒/哺乳细胞/酵母/细菌等）A：只需意图蛋白质带His标签都能够用镍柱纯化，留意排泄表达的蛋白质，假如培养基中含有杂乱的成分，其间或许含有复原剂或螯合剂，此刻培养基上清不能直接用镍柱纯化，应当先将培养基脱盐处理再上柱纯化。

　　Q：蛋白量少，引荐用多大标准的预装柱A：正常20mg/ml的载量，引荐小标准预装柱

　　Q：上清污浊，是用IDA好仍是NTA好A：上清污浊，引荐恰当稀释上清，并在此离心或许过0.45um滤膜处理。IDA或NTA都可纯化。

　　Q：预装柱纯化进程中，流速越来越慢，除了加硅胶管，还有什么办法A：引荐再生柱料。

　　Q：我在纯化时变性缓冲液里参加巯基乙醇，对镍柱是否有影响？假如不必巯基乙醇会有什么影响？A：不加是没有影响的，不过有些蛋白或许会呈现沉积的状况，这个要看蛋白特性来看的。巯基乙醇浓度不要超越10mM，或许5mM DTT

　　Q：假如表达蛋白中含有半胱氨酸没有二硫键，在纯化时是否需求加复原剂维护，一般用多大浓度A：能够不加复原剂，不加复原剂或许会有20%-30%二硫键。假如要悉数游离状况的线mM DTT

　　Q：纯化率到达多少？A：大部分蛋白可到达95%以上，特别蛋白状况不定，尤其是包容体蛋白，或许达不到95%

　　Q：洗杂蛋白时，咪唑加到40mM，意图蛋白就会掉下来，20-30mM杂蛋白又总洗不掉，重复做了几回，一直收不到想要的蛋白，请问有什么主张吗？A：20mM洗杂蛋白，洗杂缓冲液中添加NaCl 0.5M，甘油10%，triton X-100 0.5%。 50mM洗脱意图蛋白质。

　　Q：1ml能够加多少蛋白液（菌液）？A：1mL预装柱载量能够到达10mg，依据表达的蛋白质的量来决议上样体积。

　　Q：交融蛋白镍柱纯化有杂带，方针蛋白量不算小，但杂带很显着。扫除意图蛋白被降解的或许。A：缓冲液中NaCl 0.5M，甘油10%，triton X-100 0.5%。 来下降非特异性结合。

　　Q：柱子中有大气泡，且排不出去。A：手艺重力柱 装柱时 有时里边会有小气泡 关于流速和纯化都不会有影响的假如影响到了流速和纯化作用的线ml枪头将上面的筛片拨动 从头装一下上面的筛片即可

　　4. 包容体沉积用6M （假如6M不溶，补加尿素到8M）重溶，时刻短超声能够辅佐包容体溶解。

　　7. 复性缓冲液预冷到0-4℃，电磁拌和旋转下，将6M尿素中的变性蛋白，渐渐滴加到复性缓冲液中。依照1体积的变性蛋白质，20-100体积的复性缓冲液的体积比稀释。

　　9. 选作，4℃静置过夜。10. 选作，离心去除未变性的蛋白质。假如纯重力上样，引荐做此步，避免柱子阻塞不流。11. 复性蛋白质上NTA-镍柱纯化。若做的是包容体蛋白，引荐用NTA-镍柱（变性液能够直接过柱），不可用IDA-镍柱，复性后蛋白会损坏IDA镍柱

　　8M脲有点高了，并且欠好溶解；6M胍溶液太稠了，溶液流的太慢了（假如用机器，压力就会太大）。

　　A：1. 原核表达蛋白质添加蛋白量需求探索条件，乳糖代替IPTG诱导有时分表达量添加有时分削减。一般规则是假如不简单降解的重组蛋白质添加诱导时刻会添加表达量，简单降解不安稳的蛋白质需求探索一个诱导时刻，诱导时刻过长会形成蛋白质降解，表达量下降。2. 包容体复性液需求探索不同的复性办法和复性缓冲液。一般引荐先复性再纯化。3. 意图蛋白质简单降解，一般需求下降表达时分的温度，探索一个适宜的诱导时刻，纯化时在低温条件下进行，纯化时刻要快，尽量诱导完毕，尽快收菌、破菌、上柱纯化。纯化后的蛋白质保存测验DTT、甘油等维护剂，在-80℃保存。

　　A：这个状况是正常的，能够用洗耳球，可是这样做作业量太大，太累了。主张：1. 12000rpm 离心10min，假如仍是比较污浊，再离心一次。2 或许0.45um滤膜过滤一下。

　　Q：第一遍过柱速度慢，不接软管的状况下能够怎样调整加速流速。A：样品稀释，下降粘稠度。

　　Q：最终一步用8M尿素或盐酸胍洗柱是否必定要做，加尿素的作用是什么？A：不是有必要进程，但若不洗，后续纯化会有杂蛋白。加尿素能够使蛋白变性，非特异性结合的蛋白洗下来。

　　Q：色彩很淡，会不会影响作用？需求从头螯合Ni吗A：不影响作用，不必从头螯合。

　　Q：未能纯化到His标签蛋白？A：主张先承认是否为蛋白没有挂柱直接流穿？仍是蛋白未被洗脱下来？若扫除这两点，咱们还总结了以下要素，主张您逐个扫除：

　　A：检测PH及样品盒结合缓冲液的组成份。保证溶液中的螯合剂或强复原剂浓度及咪唑的浓度不高。

　　A：主张1、查看His是否表达，上游构建，改动His标签的方位（C-terminal or N-terminal)，必要时添加His个数（常用6-10个）主张2、下降流速、添加孵育时刻主张3、寻觅最佳的结合金属离子Ni2+一般是宿主细胞蛋白中纯化大大都6个组氨酸符号重组蛋白的一般常用金属离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受长度、方位、亲和符号在蛋白的露出程度、所用离子的类型、以及缓冲液的PH这几种要素影响，因而一些蛋白用其他离子或许更简单地进行纯化而不同Ni2+。

　　A：削减上样量，或运用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以下降蛋白的浓度。试用去污剂或改动NaCL的浓度，或在变性条件（去折叠）下洗脱（用4-8M脲，或4-6M盐酸胍）。

　　A：洗脱缓冲液中添加非离子去污剂（如2%Triton X-100）或添加NaCL的浓度。

　　Q：洗脱后杂带较多，什么原因？怎样优化？许多天然的蛋白也会带有HIS，所以常常会呈现HIS标签蛋白洗脱后有一些杂带

　　A：引荐1：优化咪唑浓度，以保证宿主细胞蛋白质的低结合和组氨酸符号的方针蛋白质的强结合之间的最佳平衡。分步或线性洗脱摸出最优的咪唑结合和清洗浓度；在样品中参加与结合缓冲液相同浓度的咪唑；咪唑的梯度不大（20个或更多的柱床体积），或许别离出有类似结合强度的蛋白。引荐2：挑选最适合的缓冲液条件，NaCL浓度，PH的规模都需求进行挑选。

　　Q：杂质和标签蛋白结合A：在超声前参加复原剂或去垢剂；添加去垢剂的浓度，（2%Triton X-100 or2% Tween 20)；或许在washing buffer中添加甘油的浓度（50%）削减非特异性的彼此反响。考虑添加咪唑的浓度或许改动金属离子。

　　Q：蛋白过镍柱纯化的原理A：镍能够与有His标签的碱性蛋白结合。蛋白上样后，带有his标签的蛋白特异性结合到柱子里，杂蛋白流出。镍也能够与咪唑结合，咪唑竞赛性结合到镍上，再用咪唑梯度洗脱，意图蛋白就被洗下来了，搜集穿出液，里边便是意图蛋白，再透析掉咪唑。

　　Q：是否需求孵育?仍是直接过柱流下来，直接结合了？A：直接过柱流下来，镍柱与蛋白结合很快，不需求孵育

　　Q:柱子不小心干了，怎样处理？填料呈现了结块A：能够用20%乙醇或PBS/TBS重悬一下即可。呈现结块用1ml枪吹散。

　　Q：CHO细胞表达的蛋白，能否用镍柱纯化A：只需带his标签就能够用镍柱纯化。可是蛋白质样品要预处理一下，引物cho细胞培养基上清组分比较杂乱，或许影响挂柱。

　　Q：蛋白样品怎样预处理A：各种预处理办法，比方超滤去除培养基中大部分氨基酸，硫酸铵沉积，或许透析，这个是蛋白纯化战略问题，不同的样本量，样本方式都不相同。



上一篇:镍柱纯化原理及办法
下一篇:镍柱别离纯化