运用分子间存在特异性的相互效果，运用分子间存在特异性的相互效果，运用分子间存在特异性的相互效果，它们之间都可以进行专注而它们之间都可以进行专注而它们之间都可以进行专注而又可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。又可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。又可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。基质类似物，按捺剂，辅酶基质类似物，按捺剂，辅酶基质类似物，按捺剂，辅酶抗体：抗体：抗体：抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞细胞：细胞：细胞：细胞外表特异蛋白，外源凝集素细胞外表特异蛋白，外源凝集素细胞外表特异蛋白，外源凝集素核酸：核酸：核酸：互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶激素或药物：激素或药物：激素或药物：受体，载体蛋白受体，载体蛋白受体，载体蛋白外源凝集素：外源凝集素：外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞外表受体，细胞多糖，糖蛋白，细胞外表受体，细胞多糖，糖蛋白，细胞外表受体，细胞文献将被固定在色谱基质上的分子称为文献将被固定在色谱基质上的分子称为文献将被固定在色谱基质上的分子称为，配体和基质是共价结合的，配体和基质是共价结合的，配体和基质是共价结合的，构成亲构成亲构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。和层析的固定相，称为亲和吸附剂。和层析的固定相，称为亲和吸附剂。配体以共价键结合到活化的基质上，构成固相载体配体以共价键结合到活化的基质上，构成固相载体配体以共价键结合到活化的基质上，构成固相载体一般载体选用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝照、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等。一般载体选用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝照、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等。一般载体选用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝照、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等。二氮杂戊环，英文名是二氮杂戊环，英文名是二氮杂戊环，英文名是Imidazole,Imidazole,Imidazole,假如在第一位或第三位上的假如在第一位或第三位上的假如在第一位或第三位上的氮原子上去掉那个氢原子所剩下的部份，氮原子上去掉那个氢原子所剩下的部份，氮原子上去掉那个氢原子所剩下的部份，就叫咪唑基。就叫咪唑基。就叫咪唑基。便是咪唑上去掉一个和氮便是咪唑上去掉一个和氮便是咪唑上去掉一个和氮原子直接相连的氢原子后剩下的部分原子直接相连的氢原子后剩下的部分原子直接相连的氢原子后剩下的部分：具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。：具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。：具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。Cu2+Cu2+Cu2+、、、Ni2+Ni2+Ni2+、、、Zn2+Zn2+Zn2+、、、Co2+Co2+Co2+等过渡金属离子可与等过渡金属离子可与等过渡金属离子可与NN和和和OO等供电原子等供电原子等供电原子发生配位键，因而可与蛋白质外表的组氨酸（发生配位键，因而可与蛋白质外表的组氨酸（发生配位键，因而可与蛋白质外表的组氨酸（HisHisHis）的咪唑基、半胱氨酸（）的咪唑基、半胱氨酸（）的咪唑基、半胱氨酸（CysCysCys））的巯基和色氨酸（的巯基和色氨酸（的巯基和色氨酸（TrpTrpTrp）的吲哚基发生亲和结合效果，其间以）的吲哚基发生亲和结合效果，其间以）的吲哚基发生亲和结合效果，其间以HisHisHis的咪唑基的结的咪唑基的结的咪唑基的结合效果最强。过渡金属离子与咪唑基的结合强弱次序是合效果最强。过渡金属离子与咪唑基的结合强弱次序是合效果最强。过渡金属离子与咪唑基的结合强弱次序是Cu2+Cu2+Cu2+＞＞＞Ni2+Ni2+Ni2+＞＞＞Zn2+Zn2+Zn2+Co2+Co2+Co2+。。有六个螯合价位，有六个螯合价位，有六个螯合价位，通常将镍柱分为了通常将镍柱分为了通常将镍柱分为了Ni-NTANi-NTANi-NTA和和和Ni-IDANi-IDANi-IDA。。。Ni-NTANi-NTANi-NTA四价，剩下两价；而Ni-IDANi-IDANi-IDA螯合三价，剩下三价。因而螯合三价，剩下三价。因而螯合三价，剩下三价。因而Ni-IDANi-IDANi-IDAAgaroseAgaroseAgarose结协作结协作结合效果力要比用力要比用力要比Ni-NTANi-NTANi-NTAAgaroseAgaroseAgarose强，在相同条件下在相同条件下在相同条件下Ni-IDANi-IDANi-IDAAgaroseAgaroseAgarose的载量要比的载量要比的载量要比Ni-NTANi-NTANi-NTA高，并且洗脱杂质和方针蛋白所用的缓冲液中咪唑浓度更高；并且洗脱杂质和方针蛋白所用的缓冲液中咪唑浓度更高；并且洗脱杂质和方针蛋白所用的缓冲液中咪唑浓度更高；但但但Ni-NTANi-NTANi-NTA更安稳，更安稳，更安稳，耐受更强的复原剂，耐受更强的复原剂，耐受更强的复原剂，镍离子更不易掉落。镍离子更不易掉落。镍离子更不易掉落。因而需求依据不同的纯化条件挑选纯化因而需求依据不同的纯化条件挑选纯化因而需求依据不同的纯化条件挑选纯化所需的镍柱，以到达纯化的最佳效果。所需的镍柱，以到达纯化的最佳效果。所需的镍柱，以到达纯化的最佳效果。不溶性的多孔网状结构，渗透性好；不溶性的多孔网状结构，渗透性好；不溶性的多孔网状结构，渗透性好；物理和化学安稳性高，有较高的机械强度，运用寿命长；物理和化学安稳性高，有较高的机械强度，运用寿命长；物理和化学安稳性高，有较高的机械强度，运用寿命长；抗微生物和酶的腐蚀；抗微生物和酶的腐蚀；抗微生物和酶的腐蚀；最好为粒径均一的球形粒子；最好为粒径均一的球形粒子；最好为粒径均一的球形粒子；具有亲水性，无非特异性吸附；具有亲水性，无非特异性吸附；具有亲水性，无非特异性吸附；含有可活化的反响基团，利于亲和配体的固定化。含有可活化的反响基团，利于亲和配体的固定化。含有可活化的反响基团，利于亲和配体的固定化。例：琼脂糖凝胶微球的产品名为例：琼脂糖凝胶微球的产品名为例：琼脂糖凝胶微球的产品名为SepharoseSepharoseSepharose，含糖浓度为，含糖浓度为，含糖浓度为2%2%2%、、、4%4%4%、、、6%6%6%时别离称为时别离称为时别离称为2B2B2B、、、4B4B4B、、、6B6B6B。。。SepharoseSepharoseSepharose4B4B4B的结构比的结构比的结构比6B6B6B疏松，而吸附容量比疏松，而吸附容量比疏松，而吸附容量比2B2B2B大，所以大，所以大，所以4B4B4B用最广。用最广。用最广。是可以可逆结合特定分子或特定基团的分子，是可以可逆结合特定分子或特定基团的分子，是可以可逆结合特定分子或特定基团的分子，可以经过亲和色谱的办法进可以经过亲和色谱的办法进 可以经过亲和色谱的办法进 行纯化。 行纯化。 行纯化。 配基的挑选遭到两种要素的影响：（配基的挑选遭到两种要素的影响：（ 配基的挑选遭到两种要素的影响：（11 1）：配基与方针物的结合有必要具有特异性 ）：配基与方针物的结合有必要具有特异性 ）：配基与方针物的结合有必要具有特异性 和可逆。 和可逆。 和可逆。 （222）：有必要具有化学修饰基团，使它吸附在基质上，并且不危害它的活性。 ）：有必要具有化学修饰基团，使它吸附在基质上，并且不危害它的活性。 ）：有必要具有化学修饰基团，使它吸附在基质上，并且不危害它的活性。 方针蛋白质的结合位点坐落分子中较深的部位，方针蛋白质的结合位点坐落分子中较深的部位， 方针蛋白质的结合位点坐落分子中较深的部位，假如将配基直接偶联到 假如将配基直接偶联到 假如将配基直接偶联到 基质上， 基质上， 基质上，遭到空间位阻的影响， 遭到空间位阻的影响， 遭到空间位阻的影响，配基不能到达方针蛋白的结合位点， 配基不能到达方针蛋白的结合位点， 配基不能到达方针蛋白的结合位点，因而与方针 因而与方针 因而与方针 蛋白的结合才能低。所以在配基与基质之间刺进一个距离臂可以使结合愈加容 蛋白的结合才能低。所以在配基与基质之间刺进一个距离臂可以使结合愈加容 蛋白的结合才能低。所以在配基与基质之间刺进一个距离臂可以使结合愈加容 易。距离臂使结合最大化的一起要防止非特异性结合。 易。距离臂使结合最大化的一起要防止非特异性结合。 易。距离臂使结合最大化的一起要防止非特异性结合。 距离臂的长度是要害，太短，无效距离臂的长度是要害，太短，无效 距离臂的长度是要害，太短，无效 太长，发生非特异性结合。一般规矩：偶联 太长，发生非特异性结合。一般规矩：偶联 太长，发生非特异性结合。一般规矩：偶联 的分子量小于 的分子量小于 的分子量小于1000 1000 1000 时运用距离臂；当大分子量，则不必定要。 时运用距离臂；当大分子量，则不必定要。 时运用距离臂；当大分子量，则不必定要。 蛋白质的的二硫键在半胱氨酸残基的硫醇之间构成，蛋白质的的二硫键在半胱氨酸残基的硫醇之间构成， 蛋白质的的二硫键在半胱氨酸残基的硫醇之间构成，包内蛋白脱离细胞后， 包内蛋白脱离细胞后， 包内蛋白脱离细胞后，二硫键 二硫键 二硫键 常以氧化状况存在。 常以氧化状况存在。 常以氧化状况存在。 此键在蛋白质分子的立体结构构成上起着必定的重要效果。此键在蛋白质分子的立体结构构成上起着必定的重要效果。 此键在蛋白质分子的立体结构构成上起着必定的重要效果。为了确认蛋白质的一级结构， 为了确认蛋白质的一级结构， 为了确认蛋白质的一级结构，首首 先有必要将二硫键翻开，使成为线状多肽链。先有必要将二硫键翻开，使成为线状多肽链。 先有必要将二硫键翻开，使成为线）直接上样 ）直接上样 ）直接上样 （222）间接上样 ）间接上样 ）间接上样 ）pHpH pH 值洗脱： 值洗脱： 值洗脱：pH pH pH 的改动可以改动带电荷的配基基团和结合蛋白的离子化程 的改动可以改动带电荷的配基基团和结合蛋白的离子化程 的改动可以改动带电荷的配基基团和结合蛋白的离子化程 度，使它们结合位点的亲和性下降。（下降 度，使它们结合位点的亲和性下降。（下降 度，使它们结合位点的亲和性下降。（下降 pH pH pH 的办法） 的办法） 的办法） 2离子强度洗脱：离子强度洗脱： 离子强度洗脱： 3竞争性洗脱：（咪唑）竞争性洗脱：（咪唑） 竞争性洗脱：（咪唑） 1先用强变性剂先用强变性剂 先用强变性剂6M 6M 6M盐酸胍冲刷柱子 盐酸胍冲刷柱子 盐酸胍冲刷柱子 2用水冲刷洁净用水冲刷洁净 用水冲刷洁净 302%SDS302%SDS 302%SDS 冲刷柱子 冲刷柱子 冲刷柱子 4用水冲刷洁净用水冲刷洁净 用水冲刷洁净 550%550% 550%乙醇冲刷柱子 乙醇冲刷柱子 乙醇冲刷柱子 6用水冲刷洁净用水冲刷洁净 用水冲刷洁净 7用用用100mM EDTA50mM Tris  100mM EDTA50mM Tris  100mM EDTA50mM Tris  100mM EDTA  100mM EDTA  100mM EDTA  PH 80 PH 80 PH 80冲刷柱子 冲刷柱子 冲刷柱子 8用水冲刷洁净用水冲刷洁净 用水冲刷洁净 9用用用100mM  100mM  100mM 硫酸镍孵育柱子 硫酸镍孵育柱子 硫酸镍孵育柱子 1020%1020% 1020%乙醇中 乙醇中 乙醇中44 4保存 保存 保存 Lysis Buffer Lysis Buffer  Lysis Buffer  50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl；； ；150mM NaCl 150mM NaCl 150mM NaCl；； ；20mM Imidazole 20mM Imidazole 20mM Imidazole；； ；pH80 pH80 pH80；； Elution Buffer 1 Elution Buffer 1  Elution Buffer 1  50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl；； ；150mM NaCl 150mM NaCl 150mM NaCl；； ；50mM Imidazole 50mM Imidazole 50mM Imidazole；； ；pH80 pH80 pH80；； Elution Buffer 2 Elution Buffer 2  Elution Buffer 2  50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl；； ；150mM NaCl 150mM NaCl 150mM NaCl；； ；100mM Imidazole 100mM Imidazole 100mM Imidazole；； ；pH80 pH80 pH80；； Elution Buffer 3 Elution Buffer 3  Elution Buffer 3  50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl；； ；150mM NaCl 150mM NaCl 150mM NaCl；； ；300mM Imidazole 300mM Imidazole 300mM Imidazole；； ；pH80 pH80 pH80；； IB Lysis Buffer 1 IB Lysis Buffer 1  IB Lysis Buffer 1  20mM Tris 20mM Tris 20mM Tris；； ；150mM NaCl 150mM NaCl 150mM NaCl；； ；2mM EDTA 2mM EDTA 2mM EDTA；； ；2mMDTT 2mMDTT 2mMDTT；； 1% Triton X-1001% Triton X-100 1% Triton X-100；； ；PH80 PH80 PH80；； IB Lysis Buffer 2 IB Lysis Buffer 2  IB Lysis Buffer 2  50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl；； ；150mM NaCl  150mM NaCl  150mM NaCl ；； ；8Murea 8Murea 8Murea；； pH80pH80 pH80；； IB Elution IB Elution  IB Elution  Buffer1  Buffer1  Buffer1  50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl；； 150mMNaCl150mMNaCl 150mMNaCl；； ；20mMImidazola  20mMImidazola  20mMImidazola  ；8Murea8Murea 8Murea；； pH80pH80 pH80；； IB Elution IB Elution  IB Elution  Buffer2  Buffer2  Buffer2  50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl；； 150mMNaCl150mMNaCl 150mMNaCl；； ；50mMImidazola  50mMImidazola  50mMImidazola ；； ；8Murea 8Murea 8Murea；； pH80pH80 pH80；； IB Elution IB Elution  IB Elution  Buffer3  Buffer3  Buffer3  50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl；； 150mMNaCl150mMNaCl 150mMNaCl；； ；100mMImidazola  100mMImidazola  100mMImidazola ；； ；8Murea 8Murea 8Murea；； pH80pH80 pH80；； IB Elution IB Elution  IB Elution  Buffer4  Buffer4  Buffer4  50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl；； 150mMNaCl150mMNaCl 150mMNaCl；； ；300mMImidazola 300mMImidazola 300mMImidazola；； ；8Murea 8Murea 8Murea；； pH80pH80 pH80；； IB Elution IB Elution  IB Elution  Buffer5  Buffer5  Buffer5  50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl 50mM Tris-HCl；； 150mMNaCl150mMNaCl 150mMNaCl；； ；500mMImidazola 500mMImidazola 500mMImidazola；； ；8Murea 8Murea 8Murea；； pH80pH80 pH80；； 1TritonX-100 TritonX -100 TritonX -100 TritonX -100 具亲水端和疏水端，可将膜蛋白从细胞膜上解离下来，具亲水端和疏水端，可将膜蛋白从细胞膜上解离下来， 具亲水端和疏水端，可将膜蛋白从细胞膜上解离下来， 到达提取膜蛋白的效果。常用的非离子性去垢剂。用量： 到达提取膜蛋白的效果。常用的非离子性去垢剂。用量： 到达提取膜蛋白的效果。常用的非离子性去垢剂。用量：1%-3%TritonX -100 1%-3%TritonX -100 1%-3%TritonX -100。。 2TCEPTCEP TCEP TCEP 是一种十分有用的硫醇类复原剂，广泛用作蛋白质是一种十分有用的硫醇类复原剂，广泛用作蛋白质 是一种十分有用的硫醇类复原剂，广泛用作蛋白质 化学及蛋白质组学研讨中二硫键的定量复原剂。 化学及蛋白质组学研讨中二硫键的定量复原剂。 化学及蛋白质组学研讨中二硫键的定量复原剂。该试剂在水溶液中的安稳性和溶 该试剂在水溶液中的安稳性和溶 该试剂在水溶液中的安稳性和溶 解性都很好。 解性都很好。 解性都很好。在酸性、 在酸性、 在酸性、碱性溶液中的安稳性也不错。 碱性溶液中的安稳性也不错。 碱性溶液中的安稳性也不错。与其他类别的硫醇类复原剂 与其他类别的硫醇类复原剂 与其他类别的硫醇类复原剂 DTTDTT DTT 比较， 比较， 比较，TCEP TCEP TCEP 不仅是一种高效的二硫键复原剂，并且在某些巯基的交联 不仅是一种高效的二硫键复原剂，并且在某些巯基的交联 不仅是一种高效的二硫键复原剂，并且在某些巯基的交联 反响中不需求除去。用量： 反响中不需求除去。用量： 反响中不需求除去。用量：1mMml  1mMml  1mMml  3PepstatinPepstatin Pepstatin Pepstatin 按捺酸性蛋白酶，装备时溶于甲醇中，在水中不按捺酸性蛋白酶，装备时溶于甲醇中，在水中不 按捺酸性蛋白酶，装备时溶于甲醇中，在水中不 溶解。用量： 溶解。用量： 溶解。用量：1ugml 1ugml 1ugml。。 。Store at:-4 Store at:-4 Store at:-4（ （A weekA week A week）） ）-20 -20 -20（ （Half a yearHalf a year Half a year 4LeupeptinLeupeptin Leupeptin Leupeptin 按捺丝氨酸和巯基蛋白酶，装备时溶于水，用量：按捺丝氨酸和巯基蛋白酶，装备时溶于水，用量： 按捺丝氨酸和巯基蛋白酶，装备时溶于水，用量： 1ugml 1ugml 1ugml。。 。Store at:-4 Store at:-4 Store at:-4（ （A weekA week A week）） ）-20 -20 -20（ （Half a yearHalf a year Half a year 5EDTAEDTA EDTA EDTA 螯合剂，消除微量重金属导致的酶催化反响中的抑 螯合剂，消除微量重金属导致的酶催化反响中的抑 螯合剂，消除微量重金属导致的酶催化反响中的抑 制效果。 制效果。 制效果。不影响蛋白质功用的情况下去除搅扰金属离子， 不影响蛋白质功用的情况下去除搅扰金属离子， 不影响蛋白质功用的情况下去除搅扰金属离子，可是一起能使金属蛋白 可是一起能使金属蛋白 可是一起能使金属蛋白 酶损失活性。用量： 酶损失活性。用量： 酶损失活性。用量：01 01 01—— —5mmolL 5mmolL 5mmolL。。 6GlycerolGlycerol Glycerol Glycerol 添加黏度，削减分子间的磕碰，用量：添加黏度，削减分子间的磕碰，用量： 添加黏度，削减分子间的磕碰，用量：5%-30% 5%-30% 5%-30%。。 7SDSSDS SDS SDS 可以使蛋白质变性的阴离子型去污剂， 可以使蛋白质变性的阴离子型去污剂， 可以使蛋白质变性的阴离子型去污剂，用量： 用量： 用量：01%-1% 01%-1% 01%-1%。。 8TritonX-114 TritonX -114 TritonX -114 TritonX -114 温度在温度在 温度在22 22 22以上时， 以上时， 以上时，在蛋白质溶液中参加 在蛋白质溶液中参加 在蛋白质溶液中参加2% 2% 2%的的 的TritonX  TritonX  TritonX  -114 -114 -114 可使蛋白质从去垢剂相和液相中别离， 可使蛋白质从去垢剂相和液相中别离， 可使蛋白质从去垢剂相和液相中别离，可溶性蛋白在液相中， 可溶性蛋白在液相中， 可溶性蛋白在液相中，而膜蛋白则进 而膜蛋白则进 而膜蛋白则进 入了去垢相中。（内毒素存在于细胞壁组分，菌裂解后释出物中。） 入了去垢相中。（内毒素存在于细胞壁组分，菌裂解后释出物中。） 入了去垢相中。（内毒素存在于细胞壁组分，菌裂解后释出物中。） 9DTTDTT DTT DTT 常常被用于蛋白质中二硫键的复原，可用于阻挠蛋白质 常常被用于蛋白质中二硫键的复原，可用于阻挠蛋白质 常常被用于蛋白质中二硫键的复原，可用于阻挠蛋白质 中的半胱氨酸之间所构成的蛋白质分子内或分子间二硫键。但 中的半胱氨酸之间所构成的蛋白质分子内或分子间二硫键。但 中的半胱氨酸之间所构成的蛋白质分子内或分子间二硫键。但 DTT DTT DTT 往往无法还 往往无法还 往往无法还 原包埋于蛋白质结构内部 原包埋于蛋白质结构内部 原包埋于蛋白质结构内部（溶剂不行及） （溶剂不行及） （溶剂不行及）的二硫键， 的二硫键， 的二硫键，这类二硫键的复原常常需求 这类二硫键的复原常常需求 这类二硫键的复原常常需求 先将蛋白质变性 先将蛋白质变性 先将蛋白质变性（高温加热或参加变性剂， （高温加热或参加变性剂， （高温加热或参加变性剂，如如 如6M 6M 6M盐酸胍、 盐酸胍、 盐酸胍、8M 8M 8M尿素或 尿素或 尿素或1%SDS 1%SDS 1%SDS）） 用量：用量： 用量：1-2mM  1-2mM  1-2mM  1010 10L-ArginineL- L-ArginineL- L-ArginineL- L-ArginineL- 添加蛋白质的溶解性，阻挠蛋白质分子间经过疏水作添加蛋白质的溶解性，阻挠蛋白质分子间经过疏水作 添加蛋白质的溶解性，阻挠蛋白质分子间经过疏水作 用发生凝集而发生沉积。用量： 用发生凝集而发生沉积。用量： 用发生凝集而发生沉积。用量：04-06molL  04-06molL  04-06molL  11  11  11

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